肉類含人體所需的蛋白質、脂肪和維生素等營養成分，是人們必需的主要副食品之一。從波及歐盟多 國的“馬肉風波”到國內的“老鼠肉、狐貍肉和水貂肉冒充羊肉”等事件，不僅嚴重損害了消費者的權益， 同時也帶來了諸多食品安全隱患，還可能涉及宗教信仰問題，引發社會的不安定因素。近年來，用于物種 鑒別和食品鑒定的方法在食品工業領域和監管機構中得到越來越多的關注。肉類真實性鑒別最常用的 檢測方法主要有聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）和酶聯免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）技術。但這兩種方法都存在一 定的弊端，核酸的降解和肉品的復雜基質會影響 ＰＣＲ檢測結果的準確性，而 ＥＬＩＳＡ 易發生物種間的交叉 反應產生假陽性結果，而且無法實現多個物種的同時檢測。

１ 實驗部分

１．１ 儀器與設備

ＥｋｓｐｅｒｔＴＭｎａｎｏＬＣ４００納升液相色譜－飛行時間質譜聯用 儀（ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ６６００，美 國 ＡＢＳＣＩＥＸ公司）；ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ 超高效液相色譜儀（美國，Ｗａｔｅｒｓ公司）；ＱＴＲＡＰ６５００＋三重四極桿－線性離子 阱復合質譜儀（美國，ＡＢＳＣＩＥＸ公司）；ＨｅｒａｅｕｓＦｒｅｓｃｏ２１型冷凍離心機（美國，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）； ３－３０Ｋ 型高速冷凍離心機（德國，Ｓｉｇｍａ公司）；精宏DNP-9272型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；ＢＣ－１０００渦旋振蕩器（深圳逗點生物技術有限公司）；ＣＰＡ２２４Ｓ型分析天平（德國，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；低 蛋白吸附離心管（１．５ｍＬ，德國Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；刻度離心管（１０ｍＬ，美國 ＡｘｙｇｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）；超濾 離心管（Ｍｅｍｂｒａｎｅ：１０，０００ＭＷＣＯ ＨＹ，德國Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）。

１．２ 材料與試劑

碳酸氫 銨 （分 析 純，國 藥 集 團 化 學 試 劑 有 限 公 司）；硫 脲 （ＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ ≥９９．０％，美 國 Ｓｉｇｍａ－ Ａｌｄｒｉｃｈ公司）；３－［３－（膽酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸內鹽（ＣＨＡＰＳ）（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ，ＶＷＲＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）、尿素 （ＶＷＲＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）、二硫蘇糖醇（ＤＴＴ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、碘乙酰胺（ＩＡＡ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）（美國 Ａｍｒｅｓｃｏ公 司）；測序級修飾胰蛋白酶（Ｐｏｒｃｉｎｅ，美國 Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白濃度測定試劑盒（生工生物工程上 海股份有限公司）；乙腈、水（質譜純，德國 Ｍｅｒｃｋ公司）；甲酸（質譜純，美國 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司）。實驗 前處理用水均為超純水。 雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品均為市售。

１．３ 樣品處理

１．３．１ 蛋白質提取

稱取１ｇ切碎后的肉類樣品于１０ｍＬ離心管中，加入５ｍＬ蛋白裂解液（７ｍｏｌ／Ｌ 尿 素，２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，４％ＣＨＡＰＳ），渦旋振蕩過夜，以１４０００ｒ／ｍｉｎ離心２０ｍｉｎ，取上清液至低蛋白吸附離心 管中備用。采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法測定上清液蛋白濃度。

１．３．２ 蛋白質酶解

根據測定的蛋白濃度，移取適量上清液到低吸附離心管中，加入尿素水溶液（８ｍｏｌ／Ｌ） 至２００μＬ，加入４μＬＤＴＴ水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ），置于３７℃恒溫反應１ｈ。冷卻至室溫后加入２０μＬＩＡＡ 水溶 液（１ｍｏｌ／Ｌ），避光反應１ｈ。將上述反應液轉移至超濾離心管中，于８℃、１４０００ｒ／ｍｉｎ離心４０ｍｉｎ，除去 多余的ＩＡＡ 和鹽類等小分子成分，并用碳酸氫銨溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）洗滌超濾膜上的蛋白３次（１００μＬ× ３）。向超濾管中加入１００μＬ碳酸氫銨溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）和１０μＬ胰蛋白酶溶液（１∶４０），輕輕搖勻，置于 ３７℃恒溫酶解５ｈ，８℃、１４０００ｒ／ｍｉｎ離心４０ｍｉｎ，加入９０μＬ碳酸氫銨溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）洗滌一次，收 集濾液，待質譜分析。

１．４ ＮａｎｏＬＣ－ＴＯＦＭＳ條件

色譜條件：ＥｋｓｉｇｅｎｔＮａｎｏＬＣｔｒａｐＣ１８色譜柱（０．５ｍｍ×３５０μｍ，３μｍ），ＥｋｓｉｇｅｎｔＣ１８色譜柱（１５０ ｍｍ×７５μｍ，３μｍ）。流動相 Ａ 為含０．１％甲酸水溶液－乙腈（９８∶２，Ｖ／Ｖ），Ｂ為乙腈－含０．１％甲酸水溶液 （９８∶２，Ｖ／Ｖ）。梯度洗脫程序：０～０．５ｍｉｎ，９５％～９２％Ａ；０．５～５０ｍｉｎ，９２％～７６％Ａ；５０～６５ｍｉｎ，７６％ ～６８％Ａ；６５～７４ｍｉｎ，６８％～５０％ Ａ；７４～７５ｍｉｎ，５０％～２０％ Ａ；７５～８０ｍｉｎ，２０％ Ａ；８０～８１ｍｉｎ，２０％ ～９５％ Ａ；８１～９０ｍｉｎ，９５％ Ａ。流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ；進樣體積：２μＬ。 質譜條件：采用納升電噴霧離子源（ＮａｎｏＥＳＩ），正離子掃描模式，噴霧電壓２．３ｋＶ；加熱溫度１５０℃； 氣簾氣壓 力２０６．８４ｋＰａ，霧 化 氣 壓 力４１．３７ｋＰａ；質 譜 數 據 采 集 使 用 信 息 依 賴 的 工 作 模 式（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ，ＩＤＡ）同時進行動態背景扣除。一級 ＴＯＦ－ＭＳ單張圖譜掃描時間為２５０ｍｓ，掃描范 圍：ｍ／ｚ３５０～１５００；每次ＩＤＡ 循環最多采集３０張電荷為２＋～５＋且單秒計數大于１５０的二級質譜，每 張二級質譜的累積時間為５０ｍｓ，每次循環時間為１．８ｓ。

１．５ ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ條件

色譜條件：ＡｇｉｌｅｎｔＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ 色 譜 柱 （１００×２．１ ｍｍ，１．８μｍ），柱 溫：３５ ℃。流 動 相 Ａ 為 ０．１％甲酸，流動相 Ｂ為乙腈。梯度洗脫程序：０～０．５ｍｉｎ，９５％Ａ；０．５～４ｍｉｎ，９５％～６５％ Ａ；４～７ｍｉｎ， ６５％～５０％Ａ；７～８ｍｉｎ，５０％～１０％Ａ；８～１０ｍｉｎ，１０％Ａ；１０～１０．５ｍｉｎ，１０％～９５％Ａ；１０．５～１２ｍｉｎ， ９５％Ａ。流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ；進樣體積：４μＬ。 質譜條件：采用電噴霧離子 源（ＥＳＩ）源，正 離 子 掃 描 以 多 反 應 監 測（ＭＲＭ）模 式 檢 測；噴 霧 電 壓：５．５ ｋＶ；離子源溫度：５５０℃；氣簾氣壓力：２７６ｋＰａ；霧化氣壓力：３７９ｋＰａ；輔助氣壓力：３７９ｋＰａ。

２ 結果與討論 

胰蛋白酶在ｐＨ 為８．０、溫度為３７℃時的作用能力最強，因此酶解反應在ｐＨ 相近的碳酸氫銨溶液中 進行，溫度控制在３７±０．５℃左右。在上述實驗條件下，酶解的時間是影響蛋白質水解程度的重要因素， 實驗考察了酶解２、４、６、８、１５ｈ（過夜）后質譜記錄的各特征肽段的檢測濃度。結果表明，鵝肉樣品的酶解 時間為４ｈ時，各肽段的檢測濃度達最高值且隨后趨于平衡。為了充分水解蛋白質并縮短實驗前處理時 間，酶解的反應時間選為５ｈ。特征肽段是指某一個蛋白質所特有的肽段序列，在蛋白質組學研究中可作為 區分物種屬性的生物標志物。特征肽段的選擇一般遵循以下原則：以含７～２５個氨基酸長度的肽為 宜；不含錯切或漏切的酶切位點，對于豐度較高的肽段可接受一個漏切位點；要具有穩定的物理化學性質； 質譜檢測分析時具有較好的靈敏度和峰形。借助于納升液相色譜－串聯飛行時間質譜儀對酶解后的多肽 溶液進行 ＦｕｌｌＭＳ－ＩＤＡ 掃 描，得到高準確質量數的質譜數據。將數據導入蛋白質搜索軟件 ＰｒｏｔｅｉｎＰｉ－ ｌｏｔＴＭ ，參數 設 置 為：ＳａｍｐｌｅＴｙｐｅ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＣｙｓＡｌｋｙｌａｔｉｏｎ：Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ｔｒｙｐｓｉｎ；Ｉｎ－ ｓｔｒｕｍｅｎｔ：ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ６６００；ＩＤ Ｆｏｃｕｓ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｕｎｕｓｅｄ ＰｒｏｔＳｃｏｒｅ（Ｃｏｎｆ）＞ ０．０５ （１０．０％）；ＲｕｎＦａｌｓｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＲａｔｅＡｎａｌｙｓｉｓ，并在 Ｕｎｉｐｒｏｔ蛋白數據庫中進行比對檢索。本文詳細比較 了雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉這些常見物種的多肽序列，找到６０條只存在于鵝肉樣品中的備選特 征肽段，然 后 在 ＮＣＢＩ網 站 上 進 行 ｂｌａｓｔ分 析，去 掉 非 特 異 性 的 肽 段，最 后 留 下７條 特 異 性 肽 段。利 用 Ｓｋｙｌｉｎｅ軟件導出上述７條異性肽段的 ＭＲＭ 離子對信息，并對離子對的碰撞能量進行優化，建立 ＵＰＬＣ－ ＭＳ／ＭＳ方法。

３ 結論

本研究利用納升高效液相色譜－串聯飛行時間質譜平臺，結合蛋白質檢索軟件篩選出鵝的備選特征肽 段，利用ｓｋｙｌｉｎｅ軟件導出的質譜參數，建立了 ＭＲＭ 檢測方法，并對備選特征肽段進行驗證，最終確證了 ７條鵝源性特征肽段。另外，所篩選的特征肽段中有６條肽的質譜信號與鵝肉含量呈線性相關，能夠準確 地定量鵝肉成分。



 

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