皮膚是脊椎動物最大的器官，具有自我修護的 能力，在抵御體外侵害過程中起著關鍵 的 作 用。創傷愈合是一個動態協調組織修復過程， 包括止血、炎癥、細胞增殖和重塑等一系列復雜的 過程。在每個調控環節，干擾影響其創傷修復的主 要因素包括機體免疫及巨噬細胞的活力、氧化應激 產生過量過氧化物、血小板的激活、各種因子的釋 放等。目前，常用的創傷修復藥物主要有基因 工程細胞因子、抗菌藥物、酶清創制劑、中藥制 劑、抗氧化劑和皮質類固醇等。然而，針對皮 膚外傷的天然無瘢痕制劑及創傷患者專用型臨床營 養品卻非常缺乏，急需開發有助于創傷愈合的天然 活性物質。隨著國內外對海洋來源活性肽功能的深入研究，已發現部分活性肽在皮膚組織創傷愈合方 面具有較高的潛在應用價值，如海洋膠原蛋白 肽、魚皮膠原蛋白肽等，而貝類來源的活性 肽物質目前尚未見在創傷愈合領域的報道。

馬氏珠母貝 Pinctada martensii 又稱合浦珠母 貝，是中國南方沿海地區培育珍珠的主要貝種。 隨著人工海水珍珠養殖面積的增多，馬氏珠母貝產 量日益遞增，是南海主要的漁業資源之一。養殖珍 珠貝主要用于珍珠的采集，珍珠貝肉作為珍珠副產 品，其利用程度低，主要用作鮮食或簡單加工成動 物飼料，產值低且易對環境造成污染。因此，髙值 化利用是提高馬氏珍珠貝產業經濟附加值的重要手 段。珍珠貝外套膜作為實施人工 “插核手術”的組織小片，具有較強的細胞增殖和組織修復能力，并 最終形成珍珠袋，在珍珠形成和免疫抗炎中起著重 要的作用。研究表明，珍珠貝外套膜主要營養 成分是蛋白質，主要為膠原蛋白。膠原蛋白作 為細胞外基質重要組成成分之一，對多種細胞的生 理功能具有促進作用，并誘導多種生長因子的產 生，有利于傷口愈合。因此，本研究中采用酶 法制備馬氏珠母貝外套膜酶解產物 ( enzymatic hydrolysis from mantle of pearl oyster，EHM) ，并探討 了其促進小鼠皮膚軟組織創傷愈合作用，以期為進 一步利用馬氏珠母貝外套膜開發皮膚組織創傷愈合 功能的產品和深入研究其機制提供數據參考。

試驗用馬氏珍珠貝肉于 2018 年 6 月采自廣東 省湛江市雷州市流沙養殖場，取其外套膜。 試驗試劑: 初元Ⅰ型產品 ( 主要成分為小麥 低聚肽、海洋魚皮膠原低聚肽) ，購自江中集團股 份有限公司; SPF 級 KM 小鼠體質量為 ( 20±2) g， 雄性，購于山東省濟南朋悅實驗動物繁育有限公 司; 中性蛋白酶 ( 30 000 U/g) 購自廣西南寧龐博 生物工程有限公司; 白介素－6 ( interleukin 6，IL－ 6) 、白介素－10 ( interleukin 10，IL－10) 、轉化生 長因子 β ( transforming growth factor－β，TGF－β) 、 堿性成纖維細胞生長因子 ( fibroblast growth factor 2，FGF － 2 ) 、 表皮細胞生長因子 ( epidermal Growth Factor，EGF) 、細胞生長周期素 1 ( cyclin D1，CCND1) 和羥脯氨酸測定試劑盒購自南京建 成生物工程研究所。 試驗儀器: Lynx 6000 型高速冷凍離心機、多 功能酶標儀購自 Thermo 公司; BSA224S－CW 型萬 分之一電子天平購自賽多利斯科學儀器 ( 北京) 有限公司; FE28 型 pH 計購自梅特勒－托利多儀器 ( 上海) 有限公司; DF－101T 集熱氏恒溫加熱磁力 攪拌器購自上海精宏實驗設備有限公司; FDU － 1110 型冷凍干燥機購自上海愛朗儀器有限公司; SW－CJ－2FD 型雙人超級操作臺購自蘇州凈化設備 有限公司。

參照前期團隊的酶解工藝 制備 EHM。采 用 凱 氏 定 氮 法、甲 醛 滴 定 法、雙縮脲法分別測定蛋白質含量、水解度和肽含量。

將小鼠按體質 量隨機分為 5 組，每組 20 只，分別為陰性對照組 ( 生理鹽水，劑量為 0. 1 mL /10 g 體質量) 、初元Ⅰ 型產品陽性對照組及 EHM 低 ( 0. 25 g /kg 體 質 量) 、中 ( 0. 5 g /kg 體質量) 、高 ( 1 g /kg 體質量) 劑量給藥組。將小鼠用 10%水合氯醛腹腔麻醉后， 背部剃毛、消毒，在小鼠背部剪去直徑約 0. 8 cm 的全層皮膚，造成全皮層創傷動物模型。小鼠均單 獨分籠飼養，每天灌胃給藥，每兩天對創傷口面觀 察、拍照，測量傷口大小，并記錄結果。每組試驗 設 3 個平行。

每隔兩天用游標卡 尺測量創面直徑 ( cm) 大小一次，計算創傷愈合率:

創傷愈合率= ( 第 0 天創面直徑－第 n 天創 面直徑) /第 0 天創面直徑×100%。
 

第 14 天時測量瘢痕長度 ( cm) ，計算瘢痕縮小率:

小鼠創面組織 勻漿液制備參照趙秉江的方法，分裝后保存于 超低溫 冰 箱 ( － 80 ℃ ) 中 待 測。IL － 6、IL － 10、 TGF－β、FGF－2、EGF、CCND1 和羥脯氨酸含量的 檢測均按照相應試劑盒說明書進行。

試驗數據采用平均值±標準差 ( mean ±S. D. ) 表示，采用 SPSS 20 軟件進行單因素方差分析，采 用 LSD 法進行組間多重比較，顯著性水平設為 0. 05，極顯著性水平設為 0. 01。

制備 EHM 時，選用中性蛋白酶酶解，加酶量 為 1000 U/g ( 原料) 蛋白，溫度為 50 ℃，酶解時 間為 5 h，該條件下水解度為 23. 4%，制得的 EHM 凍干粉蛋白質含量為 55. 66 g /100 g，其中，肽含 量占蛋白質含量的 21. 56%。

造模后 第 2 天，各試驗組動物創面皆已結痂，傷口周圍出 現紅腫，無液體滲出，傷口收縮均不明顯; 第 4、6、8 天時，各組創面結痂不斷變硬，創傷周圍表 面不平整，創緣皮膚收縮明顯，其中，各給藥組結 痂厚度優于對照組，創面完全封閉，呈現黑紅色; 第 10 天時，兩對照組傷口結痂部分脫落，但瘢痕 面積變化小，各給藥組小鼠傷口明顯縮小，并開始 部分脫痂、縮痂明顯; 第 12 天時，各組皆已掉痂，愈合處開始長出毛發，各給藥組進一步縮痂，中、 高劑量組二次結痂; 第 14 天時，陰性對照組多數 傷口小于 2 mm，陽性對照組和各劑量組傷口直徑 均小于 1 mm，低劑量組呈現肉紅色新生皮膚，新 生肉色組織完整。總體來看，低、高劑量組較對照 組愈合情況良好，無增生性瘢痕及瘢痕疙瘩生成。

創傷愈合是一個動態協調組織修復過程，包括 3 個/4 個重疊階段: 止血/炎癥、細胞增殖和重塑。 本研究中初步探討了珍珠貝外套膜酶解產物對小鼠 皮膚創傷愈合的影響，并以愈合階段特征為切入 點，測定各階段試驗動物皮膚組織相關生化指標， 進一步探討了其促進傷口愈合的可能作用機制，為 開發術后臨床營養支持和防治創傷愈合不良的產品 提供重要科學依據。Pastar 等研究表明，IL － 6 由 M1 型巨噬細 胞分泌，屬于促炎癥因子; IL－10 由 M2 型巨噬細 胞分泌，屬于抑制炎癥因子。Du 等研究表明， 第 3、5 天是炎癥反應階段，IL－6 含量在損傷后 1 d 顯著增加，在第 3 天時達到峰值，第 7 天時 IL－6 含量減低。本研究結果表明，不同劑量的 EHM 對 創傷皮膚組織中 IL－6 含量的影響不顯著; 第 3 天 時，各給藥組創傷模型動物皮膚組織中 IL－10 含量 極顯著高于陰性對照組，同時，隨時間延長含量降 低，這與張慧等報道的 IL－10 含量在第 3 天時 達到高峰期，之后開始下降的研究結果一致。Du 等研究表明，通過減少促炎 M1 巨噬細胞極化 和促進抗炎 M2 極化可減輕炎癥。本研究中陽性對 照組 ( 初元Ⅰ型產品) 配方中的海洋魚皮膠原低 聚肽、酪蛋白磷酸肽具有抑制炎癥功效，與試驗結果一致。同時，EHM 有較高含量的蛋白及 肽，這有利于 EHM 促進 IL－10 分泌，從而起到抑 制炎癥反應的作用。