膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤， 據報道，中國腦膠質瘤年發病率為 3～6 人/10 萬人，年死亡人數達 3 萬人。膠質瘤為浸潤性生長， 和正常腦組織沒有明顯界限，難以完全切除，對放療、化療不甚敏感，非常容易復發，至今仍是全身 腫瘤中預后最差的腫瘤之一。將抗腫瘤藥物與引經 藥聯合使用，增加治療藥物靶區的濃度，是提高腦 膠質瘤治療效果的有效手段。

1 材料

1.1 藥品及試劑

TMZ，批號 K19A9B58889，源葉生物科技有限 公司；VO，批號 20170614，其中總內酯質量分數 為 50.27%，藁本內酯質量分數為 30.67%，陜西昊 辰生物科技有限公司；聚山梨酯-80，Solarbio 公司； ECM 基礎培養基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉 素雙抗，Sciencell 公司；Ham’s F-12K 培養基、馬 血清，美國 Hyclone 公司；FBS，美國 Gibco 公司； 胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、Hanks 緩沖液、 固體石蠟、樹膠、磷酸鹽緩沖液（PBS）、4×蛋白 上樣緩沖液、0.22 μm PVDF 膜、1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8、1 mol/L Tris-HCl pH 6.8、10×電轉液、5×Tris 甘氨酸電泳緩沖液、牛血清白蛋白（BSA）、20×TBS、 彩虹 245 plus 廣譜蛋白 Marker，Solarbio 公司；P-gp 抗體（Abcam 公司）；GAPDH 抗體、辣根酶標記山 羊抗小鼠 IgG、HRP 辣根酶標記山羊抗兔 IgG，北 京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光劑、BCA 試劑盒，天根生化科技有限公司；二甲苯、無水乙 醇、甲醛均為西隴科學股份有限公司產品。

1.2 儀器

AE31 倒置生物顯微鏡，麥克奧迪實業集團有 限公司；01220 數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有 限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安 泰空氣技術有限公司；Forma 3111 二氧化碳恒溫培 養箱，Thermo Electron 公司；3-18K 離心機，德國 Sigma 公司；Agilent1260 高效液相色譜儀，美國 Agilent 公司；多功能酶標儀，Thermo 公司；冰箱， 青島海爾股份有限公司；腦立體定向儀，德國 Kopf 公司；電動牙科鉆，美國 Foredom 公司；微量注射泵，美國 KD Scientific 公司；RM2255 型包埋機、 EG1150H 型切片機、HI1210 型攤片機、HI1220 型 烘片機均為德國萊卡公司產品；BX43 型光學顯微 鏡，日本 Olympus 公司；A-35 型刀片，日本 Feather 公司；精宏DNP-9052 電熱恒溫培養箱，上海精宏實驗 設備有限公司；GL-6250A 磁力攪拌器、TS-8 脫色 搖床，海門其林貝爾儀器制造有限公司；1645050 電泳電源、1658001 垂直電泳槽，BioRad 公司； Chemiscope 6000 Pro 熒光及化學發成像系統，上海 勤翔科學儀器有限公司。

1.3 細胞及動物

大鼠 C6 膠質瘤細胞，上海中喬新舟生物科技 有限公司；U87-MG 細胞，北京北納創聯生物技術 研究院；SPF 級雄性 Wistar 大鼠，體質量 220～240 g，南京君科生物科技有限公司，實驗動物許可證號 SCXK（滬）2013-0016，由江西中醫藥大學實驗動 物中心按 SPF 級動物標準飼養

2 方法

C6 細胞加入適量含有 15%馬血清、2.5% FBS 的 Ham’s F-12K 培養液，置于 37 ℃、5% CO2 的培 養箱中培養。取對數期細胞，常溫下經 0.25%胰酶 消化，吹打細胞制成細胞懸液，將細胞轉置于離心管中，細胞計數板計數，用臺盼藍排斥實驗確定細 胞存活率，需存活率＞95%。離心管中剩余細胞以 1 000 r/min 離心 3 min，棄去上清液，調整細胞密度 為 7×107 個/mL 用于接種。U87-MG 細胞培養基為 含 10% FBS 的 DMEM，培養方法同 C6 細胞。大鼠接種 C6 細胞 2 周后，隨機抽取 5 只，取 瘤區腦組織做病理切片，判斷模型復制是否成功。 若鏡下見梭形細胞呈浸潤性生長，細胞異型性明顯， 核分裂相易見，腫瘤微血管豐富，中心有明顯的出 血及柵欄狀壞死，表明造模成功。隨機將制備成功 的模型大鼠分為模型組（給予雙蒸水）、TMZ 組（25 mg/kg）、TMZ＋VO 低劑量組（TMZ/VO 2.5，25 mg/kg＋2.5 mg/kg）、TMZ＋VO 高劑量組（TMZ/VO 5，25 mg/kg＋5 mg/kg），每組 15 只，ig 給藥，連 續給藥 5 d，給藥體積為 10 mL/kg。各組大鼠給藥后 10%水合氯醛麻醉，仰臥位固 定，以橫膈肌處為起點，將胸部皮毛、肌肉組織剪 開，切開縱膈肌，將兩側肋骨剪斷，用止血鉗夾住 前胸肋骨劍突向上翻起，以便暴露心臟，用鑷子將 心臟固定，將灌注針從左心室插入主動脈弓起始部， 用止血鉗固定心臟及針頭，剪開右心耳，先用 300 mL 37 ℃生理鹽水進行快速灌注，再用 200 mL 4% 多聚甲醛固定液 20 min 內勻速灌注。灌注完畢后， 開顱，將腦組織完整取出，在 4%多聚甲醛溶液內 固定 1 周。將腫瘤組織從腦內完整的剝離取出，稱 質量，并測量腫瘤短徑（a）和長徑（b），計算腫瘤 體積（V）及腫瘤體積抑制率，腫瘤體積抑制率＞ 30%，表明腫瘤對藥物敏感。

3 結果

造模前各組大鼠體質量無統計學 差異，造模后當天給予充足飼料，第 2 天觀察大鼠 已開始自行覓食、飲水。術后大鼠食物和水的攝入 較術前均有減少。模型組大鼠術后出現精神狀態萎 靡不振，毛發不整潔、黯淡無光，反應遲鈍，活動 量減少，聚集成堆等表現，個別伴有腹瀉等癥狀， 體質量下降明顯；7～14 d 大鼠暴躁易怒，攻擊力增 強，多數有明顯的腦部腫起，部分出現眼眶周圍出 血、鼻出血、偏癱等顱內高壓的癥狀。TMZ、TMZ/VO 2.5 和 TMZ/VO 5 組大鼠術后 14 d 內精神狀態及顱 內高壓癥狀表現與模型組相同，連續給藥 5 d 后， 部分大鼠頭部的腫起逐漸消失，毛發光澤度較模型 組光亮；14 d 后給藥組大鼠體質量有緩慢上升的趨 勢，TMZ/VO 2.5 和 TMZ/VO 5 組大鼠給藥后體質 量比模型組及 TMZ 組大鼠上升更快，與模型組比 較差異顯著（P＜0.05）。

4 討論

腦膠質瘤是最常見的顱內惡性原發性腦腫瘤，致死率高，由于其浸潤性生長，和正常腦組織沒有 明顯界限，手術難完全切除，對放療、化療不甚敏 感，因此腦膠質瘤至今仍是全身腫瘤中預后最差的 腫瘤之一。研究者利用腫瘤表面特異性高表達的受 體作為藥物遞送系統作用靶點構建一級靶向給 藥系統，以及在一級靶向的基礎上增加腦靶向的二級靶向。



 

免責聲明：文章僅供學習和交流，如涉及作品版權問題需要我方刪除，請聯系我們，我們會在第一時間進行處理。