釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又稱面包酵 母、出芽酵母，是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，也是 發(fā)酵中最常用的生物種類。釀酒酵母在麥芽汁瓊脂培 養(yǎng)基上菌落為乳白色、有光澤、平坦、邊緣整齊，無性繁 殖以芽殖為主。在生理特性方面，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽 糖、半乳糖和蔗糖，不能發(fā)酵蜜二糖。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

從吉林市昌邑區(qū)左家鎮(zhèn)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究 所野生山葡萄園（ZJ）、吉林市昌邑區(qū)左家鎮(zhèn)農(nóng)大紅山葡萄園（NDH）、通化市柳河縣青木原山葡萄基地 （LH），分別采集成熟的山葡萄樣本和山葡萄園土壤樣 本各 3 份，樣本總計(jì) 18 份，裝入無菌袋中常溫保存，立 即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室菌種分離鑒定。

1.2 儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)震蕩器（ZDP-250，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；微生物培養(yǎng)箱（DHP，上海一恒科學(xué)儀器有限 公司）；生物安全柜（Thermo 1300 Series A2）、PCR 儀 （Veriti）〔賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司〕；臺(tái)式冷 凍離心機(jī)（5415R，德國(guó)艾本德股份公司）；凝膠電泳 儀（Bio-Rad PowerPac HC）、紫外凝膠成像儀（BioRad Gel Doc TM XR+）（美國(guó)伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限 公司）。 麥芽汁培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）； 酵母粉、蛋白胨（英國(guó) Oxoid 公司）；酵母基因組 DNA 提取試劑盒、LA-Taq DNA 聚合酶、DNA Make〔r 寶生物工程（大連）有限公司〕；其他試劑均為國(guó) 產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 菌種的篩選

麥芽汁固體培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基 131 g、瓊脂粉 20 g，加蒸餾水至 1 L，121 ℃滅菌 30 min，然后倒入平 板，冷卻后 4℃保存?zhèn)溆谩PD 液體培養(yǎng)基：2%葡萄 糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，121℃滅菌 30 min，冷卻后 4 ℃保存?zhèn)溆谩?稱取每份山葡萄樣本 10 g，置于無菌研缽中研磨， 將山葡萄汁轉(zhuǎn)入 100 mL 滅菌蒸餾水的三角燒瓶中充 分振蕩 15 min；稱取采集的土壤樣本每份 1 g，加入至 9 mL 的滅菌蒸餾水中，充分振蕩 10 min，靜置 5 min。 分別 10 倍梯度稀釋山葡萄汁水溶液和土壤水溶液至 10 4、10 5，取稀釋液 100 L 涂布麥芽汁固體培養(yǎng)基 平板，28 ℃倒置培養(yǎng) 3 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

2.2 菌株的分離優(yōu)化

挑取麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況良好的單菌 落，轉(zhuǎn)移至含有 50 mL YPD 培養(yǎng)基的三角燒瓶中，12 層紗布封口，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng) 36 h，測(cè)定細(xì)菌 生長(zhǎng)濃度 OD600 值。

2.3 菌株理化性質(zhì)鑒定

糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)分離的菌株進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定。

2.4 酵母基因組的提取

取 1~2×10 8 酵母菌的過夜培養(yǎng)液至 1.5mL 的 Microtube 中，12 000 r/min 離心 1 min。棄去上清，加 入 500 L 的 GenTLE Yeast Solution A，輕微振蕩重懸 沉淀，37℃溫浴 1 h，期間輕輕振蕩離心管數(shù)次。加入 100 LGenTLE Yeast Solution B，輕微振蕩混勻，70 ℃ 溫浴 10 min。加入 200 LGenTLE Yeast Solution C， 輕微振蕩混勻，冰浴 5 min，12 000 r/min 4 ℃離心 5 min。取上清于新的離心管中，加入 1/2 體積的異 丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，12 000 r/min 4℃離 心 5min，棄上清。加入 500 L 預(yù)冷的 70%乙醇，輕 輕顛倒洗滌沉淀，12 000 r/min 4 ℃離心 5 min，棄上 清。室溫下干燥，加入適量的 TE Buffer 溶解， 20℃ 保存?zhèn)溆谩?br />
3 結(jié)果 

在采集的各土壤和山葡萄樣本中均有圓潤(rùn)、白色、 整齊、形態(tài)較好的單菌落生長(zhǎng)。挑取其中生長(zhǎng)良好的單菌落共計(jì) 27 個(gè)菌落，轉(zhuǎn)入 YPD 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株分離優(yōu)化，測(cè)定 24 h 和 36 h 的生長(zhǎng)速度，以 OD600 計(jì)算。其中， 編號(hào)為 ZJ-02、ZJ-06、NDH-01、NDH-05、NDH-09、 LH-03、LH-05、LH-06 和 LH-08 共 9 株菌生長(zhǎng)情況較 差，后續(xù)研究將這 9 株菌舍棄。分離的 18 株酵母菌 26S rRNA D1/D2 區(qū)基因序 列經(jīng)過 PCR 克隆和測(cè)序后，在 NCBI GeneBank 數(shù)據(jù) 庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，依據(jù)分離株與標(biāo)準(zhǔn)株親緣關(guān)系，構(gòu) 建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)分離株進(jìn)行分類。

4 結(jié)論

山葡萄作為釀酒原料已經(jīng)有70多年的歷史， 酵母是釀酒工藝中最關(guān)鍵的因素之一。本研究 選擇的樣本采集地點(diǎn)位于吉林省內(nèi)山葡萄優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)和 種植資源基地，種質(zhì)優(yōu)良、資源豐富。從采集的土壤和 山葡萄樣本中經(jīng)過菌株的分離優(yōu)化、生理生化試驗(yàn)和 分子生物學(xué)鑒定，成功分離出 18 株酵母菌，其中有釀 酒酵母 12 株、發(fā)酵畢赤酵母 3 株、乳酸克魯維酵母 3 株；從樣本分布區(qū)域來看，分離出的釀酒酵母大多數(shù)為 自然生長(zhǎng)酵母菌，占本次分離結(jié)果的 66.7%。為釀酒 酵母菌株選育、飼料釀酒酵母產(chǎn)品、有機(jī)礦物元素酵母 鐵酵母銅飼料添加劑產(chǎn)品的研究提供了充足的菌種資源。



 

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