動物脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是體 內(nèi)催化合成長鏈脂肪酸途徑中的關(guān)鍵酶，是能量代 謝的一個多功能復(fù)合酶。研究表明，近年來發(fā)現(xiàn) FAS 成為新的減肥和抗癌的雙重潛在靶點。開發(fā)具 有高活性、低毒性的 FAS 抑制劑，對癌癥的防治具 有重大的意義 。迄今為止已報道的從天然產(chǎn)物中分 離得到的 FAS 抑制劑還很少，只有最早發(fā)現(xiàn)的天然 產(chǎn)物淺藍(lán)菌素（cerulenin）和以淺藍(lán)菌素結(jié)構(gòu)為模版用化學(xué)方法合成的 C75，以及綠茶中的酯型兒茶素 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG） 和表兒茶素沒 食子酸酯（ECG）。從天然中草藥中尋找抑制活性更 高的 FAS 抑制劑是有重大意義的。

合歡皮，安徽盛海堂中藥飲片有限公司；雞肝 （江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院動物房）；D101 大孔樹脂（批 號：20170623），滄州寶恩吸附材料科技有限公司； 層析硅膠 200-300 目（批號：2017049），國藥集團化學(xué) 試劑有限公司；GF254 硅膠板（批號：201700043）， 乳山市太陽干燥劑有限公司。 乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷均為分析 純；甲醇（色譜純，批號：13030126），美國 TEDIA 公司；超純水（PALL CascadaLS），美國頗爾公司； 乙二胺四乙酸二鉀鹽（EDTA-2K，批號：327B032）， 北京索萊寶科技有限公司；二硫蘇糖醇（DTT，批 號：C10114900），上海麥克林生化科技有限公司； 乙酰輔酶 A（批號：435K022），北京索萊寶科技有限 公司；還原型輔酶Ⅱ（NADPH）（批號：1128J022）， 北 京 索 萊 寶 科 技 有 限 公 司 ； 油 酸（OA， 批 號 ： 5827240），北京索萊寶科技有限公司；無游離脂肪 酸的牛血清白蛋白（BSA，批號：2626940），北京索萊 寶科技有限公司；油紅 O 染色液（批號：1219D051）， 北 京 索 萊 寶 科 技 有 限 公 司 ； EGCG（ 批 號 ： 7264D102），北京索來寶科技有限公司；丙二酰輔酶 A（批號：TFGL6264K），美國 Sigma 化學(xué)試劑有限公 司；棕櫚酸（PA，批號：MKBQ7543V），美國 Sigma 化 學(xué) 試 劑 有 限 公 司 ； 磷 酸 氫 二 鉀（ 批 號 ： 20130923），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫 鉀（批號：20160516），國藥集團化學(xué)試劑有限公 司；碳酸氫鉀（批號：20151005），國藥集團化學(xué)試 劑有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號：AD23420270）， 美國 Hyclone 公司；胎牛血清（批號：OX0524），上 海雙洳公司；胰蛋白酶（批號：2231041），北京索萊 寶科技有限公司。 細(xì)胞培養(yǎng)皿（批號：430167），美國 CORNING 公 司；12 孔板（批號：8054899），美國 Thermo 公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A），上海亞榮生化儀 器廠；超高速多功能粉碎機（SZ-1000A-3），永康市 善竹貿(mào)易有限公司；真空干燥箱（DZF-1），上海博泰 實驗設(shè)備有限公司；三用紫外分析儀（ZF-1），海門 市其林貝爾儀器制造有限公司；高功率數(shù)控超聲波 清洗器（KQ-800KDE），昆山市超聲儀有限公司；分 析天平（AL104），瑞士梅特勒-托利多（上海）儀器有 限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2），上海精宏實驗設(shè) 備有限公司；循環(huán)水真空泵（SHZ-DⅢ），鞏義市予 華儀器有限責(zé)任公司；半制備高效液相色譜儀（1525 系列），美國 Waters 公司；全功能微孔板檢測儀 （Synergy H4），美國 BioTek 有限公司；小型臺式離 心機（MedifugeTM），南京寶誠生物技術(shù)有限公司； 超速冷凍離心機（80 000 rpm/CP80NX 型），上海旦鼎 國際貿(mào)易有限公司。

FAS 上清液參考該方法所得，在此基礎(chǔ) 上，通過酶標(biāo)儀測定 NADPH 的變化值來測定活性。 于含有 1 mmol·L- 1 EDTA、pH 值為 7、濃度為 0.1 mmol·L-1 的磷酸鉀緩沖液中進(jìn)行，底物濃度為乙酰 CoA 6 μmol·L-1 ，丙二酰 CoA 12 μmol·L-1 ，NADPH 37.5 μmol·L-1 ，體積為 2 mL，于 37 ℃水浴恒溫 4～ 5 min，加入 50 μL 稀釋后的高速離心上清液啟動酶 反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀測定。每次從反映體系中吸取 200 μL 反應(yīng)體系溶液于 340 nm 波長處連續(xù)監(jiān)測吸光 度變化。 動物 FAS 的活性單位（U）規(guī)定為每分鐘氧化 14 nmol NADPH 的酶量，每毫升高速離心上清液酶活力 用下式計算：Activity(V/L) = △A340 nm ε × V × 106 14 × C。式 中：V 為測定酶活的體積數(shù) 0.000 2 L；C 為稀釋倍 數(shù)；106 為 mmol 轉(zhuǎn)換為 nmol 系數(shù)；△A340 nm 為 340 nm 波長下的吸光度變化值；ε 為 NADPH 氧化為 NADP+ 時在 340 nm 波長處的毫摩爾消光系數(shù)，此處 為 6.022 L·mmol-1 。 被測樣品加入反應(yīng)體系，加入 FAS 啟動反應(yīng)， 測得酶活為 A，空白對照酶活為 A0，A/A0 為剩余活 性（R.A），R.A 越小，酶反應(yīng)抑制程度越高，表明樣 品的抑制酶活性能力越強。

將合歡皮藥材 2.5 kg 打 碎成粉，加入 75%乙醇，在 75 ℃下用水浴回流提取 兩次，料液比為 1∶10 g·mL-1 ，回流提取時間為 2 h。合并兩次提取液，減壓濃縮，真空干燥，得到合歡皮 總提取物 AJ-T 250 g。總提取物用蒸餾水溶解，然后 分別用乙酸乙酯、水飽和正丁醇分級萃取，萃取液 減壓濃縮，分別得到乙酸乙酯相（124.7 g）、正丁醇 相 AJ-B（52.4 g）、母液水相（23.5 g）。

取 AJ-B 干粉 20 g， 用去離子水溶解，水溶液經(jīng)過 D101 大孔樹脂柱洗 脫，依次用 3 倍柱體積的水、30%乙醇、50%乙醇、 70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，得到 4 個組分：30% 乙醇洗脫組分（AJ-B-1），50%乙醇洗脫組分（AJ-B2），70%乙醇洗脫組分（AJ-B-3），95%乙醇洗脫組分 （AJ-B-4）。4 個組分通過上述方法進(jìn)行酶活測定， 篩選出活性最高的組分。

通過薄層色譜 法，確定洗脫劑為二氯甲烷-甲醇。選取粒徑為 200~ 300 目硅膠分離，硅膠干法上樣，薄層色譜法實時檢 測并收集合并組分。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，共得到 6 個組分：Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6。6 個組分 通過酶活測定，篩選出活性最高的組分 Fr4。

Fr4 組分 采用半制備型 高效液相色譜（HPLC）對 Fr4 進(jìn)行分離，使用 Waters 1525 半制備高效液相色譜儀，C18 色譜柱；流動相： 0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）；檢測波長：254 nm； 流動相梯度洗脫程序：0～15 min：10%～30% B； 15～50 min：30%～38%B；50～65 min：38%～80%B； 65～66 min：80%～100% B；66～76 min：100% B； 76～80 min：100%～20%B；80～85 min：20%B。 共收集到 4 個化合物 H1、H2、H3、H4，對應(yīng) 的出峰時間為 32.35、34.4、38.9、45.72 min。酶活 測定篩選出活性最高的化合物 H2，通過 LC-MS，核 磁共振波普確定化合物 H2 為無梗五加苷 B。

根據(jù) HepG2 細(xì)胞 的生長狀態(tài)，選擇高糖的含有 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5%CO2濕潤環(huán)境的培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞長至 80%～90%時傳代接種，選 取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。將 HepG2 細(xì)胞吹散 均勻接種到 12 孔板，細(xì)胞密度為 4×105 個·mL-1 ，每 孔終體積 1 mL。造模前用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞 12 h， 在 HepG2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)的同時以 2∶1 加入 OA 和 PA，總濃度為 1 nmol·L-1 。為去除血清中脂肪酸的干 擾，同時滿足細(xì)胞的生長，采用無游離脂肪酸的 5% BSA 培養(yǎng)細(xì)胞。置于 37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，造模 24 h 之后，分空白組、造模組、給藥組、陽性 對照組（EGCG）。給藥處理 24 h 之后進(jìn)行油紅 O 染 色。給藥處理 24 h 之后，小心輕緩倒去培養(yǎng)液，磷 酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗 2 次，10%中性甲醛固定 30 min；PBS 漂洗，油紅工作液染色 20 min，60%異 丙醇脫色處理。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴染色 情況。

所有數(shù)據(jù)均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差” （x ± s）表示，利用統(tǒng)計軟件 SPSS17.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分 析，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組 間兩兩比較采用獨立樣本 t 檢驗。P＜0.05 為差異有 統(tǒng)計學(xué)意義。

大孔樹脂不同洗脫組分對 FAS 活性的抑制 通 過大孔樹脂洗脫，并且對不同的洗脫組分進(jìn)行抑酶 活性比較，每組實驗重復(fù) 3 次。結(jié)果如圖 1 所示。 在同一濃度的不同洗脫部位組分對脂肪酸合酶的抑 制作用結(jié)果顯示：相比較于其他組分，30%洗脫組分 （AJ-B-1）對脂肪酸合酶的抑制作用最強。

關(guān)于天然產(chǎn)物中抑制脂肪酸合酶活性成分的報道 有很多，但是大多是研究到其活性組分，從天然產(chǎn) 物中分離純化得到的抑制脂肪酸合酶活性的化合物 還非常少。本實驗室長期從事合歡皮 AJ-B 活性的藥 理研究，前期實驗室的李曰研究表明：在動物實驗 上，合歡皮 AJ-B 對脂肪酸合酶的蛋白表達(dá)水平上有 抑制作用。因此，為了比較全面地研究合歡皮中抑 制 FAS 的活性組分，我們選用合歡皮 AJ-B 作為起始 點。本研究以抑制 FAS 活性為導(dǎo)向篩選合歡皮正丁 醇相中的活性化合物，通過大孔吸附樹脂在不同的 乙醇濃度下洗脫，富集到抑制 FAS 活性較高的 30% 乙醇洗脫段，30%乙醇洗脫段在硅膠柱層析分離下得 到抗 FAS 活性較高的的組分 Fr4。使用半制備液相色 譜分離 Fr4，進(jìn)一步得到抗 FAS 活性較強的化合物 H2。結(jié)合質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)鑒定該化合物為無梗 五加苷 B。在細(xì)胞實驗上發(fā)現(xiàn)無梗五加苷 B 對腫瘤 細(xì)胞脂滴的生成具有抑制作用，我們推測其可能是 通過抑制 FAS 的活性從而抑制脂滴的生成，但其具體確切的作用機制還有待研究。因此，我們將繼續(xù) 深入研究其降脂的作用機制，期待在更深層次的藥 理機制上有所貢獻(xiàn)。