營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(vegetative insecticidal proteins, Vips)是由蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringi? ensis, Bt)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期分泌的一種殺蟲(chóng)蛋白?最早由 Estruch等(1996)從蘇云金芽胞桿菌AB88菌株離心 的上清液中發(fā)現(xiàn)?Vip3A 蛋白對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有 廣譜的殺蟲(chóng)活性,與任何已知的殺蟲(chóng)晶體蛋白均沒(méi) 有同源性;隨著害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)晶體蛋白抗性的產(chǎn)生, Vip 蛋白成為一個(gè)極為豐富且潛力巨大的資源 (Beard et al., 2008; Ramasamy et al., 2008; Yu et al., 2012)。

關(guān)于Vip蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究,迄今主要集 中在Vip3Aa (Song et al., 2016)?但是,與目前研究 比較深入的殺蟲(chóng)晶體蛋白相比,關(guān)于 Vip3 蛋白的 結(jié)構(gòu)?功能及作用模式等方面的報(bào)道較少,并且未 得出一致的結(jié)論(Chakroun et al., 2016)?部分研究 表明,絲氨酸突變對(duì)Vip3Aa殺蟲(chóng)活性影響較大,例 如,Vip3Aa11氨基端的第9位絲氨酸突變?yōu)樘於?胺(S9N)?第193位絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸(S193T)后, 對(duì)甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉鈴蟲(chóng)(Heliothis armigera)的殺蟲(chóng)活性有明顯提高(Liu et al., 2017)? Dong 等(2012)將 Vip3Aa7 中的半胱氨酸突變?yōu)榻z 氨酸,獲得的突變體(C292S, C507S, C401S)對(duì)小菜 蛾(Plutella xylostella)殺蟲(chóng)活性明顯降低,甚至喪失 活性?Chi等(2017)將Vip3Aa的543位絲氨酸突變 為天冬酰胺(S543N)?686 位絲氨酸突變?yōu)榫彼?(S686R),獲得的突變體對(duì)甜菜夜蛾殺蟲(chóng)活性分別 提高5倍和8.98倍。

雖然前人已經(jīng)對(duì)Vip3Aa11的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 進(jìn)行了一些探索,但要完全闡明 Vip3Aa11 的殺蟲(chóng) 機(jī)理尚需更廣泛的研究?本課題組比對(duì)Vip3Aa11 與Vip3Aa39氨基酸序列的差異,選定3個(gè)位于活性 中心區(qū)?可能參與絲氨酸突變的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，利用甜菜夜蛾和棉鈴蟲(chóng)進(jìn)行殺蟲(chóng)活性測(cè)定，并 進(jìn)行胰蛋白酶敏感性及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，旨在探 尋影響殺蟲(chóng)活性的氨基酸位點(diǎn)及其殺蟲(chóng)活性變化 原因，為殺蟲(chóng)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)材料。

定點(diǎn)突變所用的質(zhì)粒pET-vip3Aa11?大腸桿菌 (Escherichia coli) BL21(DE3)和 JM109 菌株均由東 北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存? 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 和 DpnⅠ (DMT)酶購(gòu)自 TransGen Biotech (北京);質(zhì)粒提取 試劑盒?DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen (美國(guó)); PageRuler Prestained Protein Ladder 購(gòu) 自 Thermo Scientific (美國(guó));Gel Red 核酸染料購(gòu)自 BIOTIUM (美國(guó))。

根據(jù) vip3Aa11 基因(GenBank No. AAR36859) 全長(zhǎng)序列,通過(guò) DNAMan 7.0 設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物, 引物設(shè)計(jì)包含5'端重疊區(qū)和3'端延伸區(qū);除突變位 點(diǎn)外,引物長(zhǎng)度大約25~30 bp,5'端重疊區(qū)包含15~ 20 bp,3'端延伸區(qū)包含至少10 bp?突變位點(diǎn)位于2 條引物上,分別位于正向突變引物重疊區(qū)下游?緊 鄰重疊區(qū)和反向突變引物 5'端?引物由上海生工 生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以轉(zhuǎn)化 E. coli JM109 菌株的 pET-vip3Aa11 質(zhì) 粒為模板,分別以G200S-F/R?F442S-F/R和S726TF/R為引物(表1),PCR擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的vip3Aa11 基因全長(zhǎng)片段?PCR反應(yīng)體系均為:質(zhì)粒1 μL,正反向突變引物(10 μmol/L)各 1 μL,2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL,加 ddH2O 至 50 μL? PCR 反應(yīng)條件均為:94 ℃預(yù)變性 2 min;94 ℃變性 20 s,55 ℃退火 20 s,72 ℃延伸 3 min,23 個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min? 為有效篩選突變克隆,需利用DMT酶體外降 解非突變型質(zhì)粒模板?因此,將1 μL DMT酶加入 50 μL PCR產(chǎn)物中,混合均勻,于37 ℃孵育1 h?取 5 μL酶消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21,挑取單克隆并送 至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定分 析,以驗(yàn)證預(yù)期突變位點(diǎn)的堿基變化是否正確。

挑取1.3中含預(yù)期突變位點(diǎn)的E. coli單菌落于 5 mL 液體 LB 培養(yǎng)基,于 37 ℃?220 r/min 活化過(guò) 夜?以 1% 接種量接種于 50 mL LB 液體培養(yǎng)基, 于 37 ℃?220 r/min 培養(yǎng) 2~2.5 h,直至 OD600 約為 0.5?加入終濃度為 1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫 代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG), 于 150 r/min?16 ℃誘導(dǎo) 12 h;于 4 ℃?8 000 r/min 離心 8 min,收集菌體沉淀 ;以 5 mL 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)懸浮;經(jīng)超聲波破碎(參數(shù)設(shè)置: 功率 70%; 超聲 3 s, 間隙 1 s, 全程 3 min),于 4 ℃? 12 000 r/min離心15 min,收集上清液。

取 Vip3Aa11 及其突變體蛋白樣品加入 5×上 樣緩沖液,混勻并煮沸 8 min,于 12 000 r/min 離心 1 min,取 5 μL 上清液進(jìn)行 SDS-PAGE,電壓為 120V,分離膠濃度為10%?然后以考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn) 行凝膠染色?對(duì)于凝膠上的蛋白條帶,使用軟件 QuantityOne 4.5進(jìn)行定量分析:選取3個(gè)已知濃度 的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 為蛋白定量標(biāo)準(zhǔn),選取凝膠空白區(qū)為背景(background),選取 Vip3Aa11 及其突變體中 88 kD 的目 的條帶,經(jīng)軟件處理得到目的蛋白濃度。

在室內(nèi)殺蟲(chóng)活性測(cè)定中,稱(chēng)取30 g人工飼料置 于培養(yǎng)皿中,分別與3 mL不同濃度的Vip3Aa11及 其突變體蛋白樣品混合,均勻分裝于24孔板中;其 中,甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的殺蟲(chóng)活性測(cè)定設(shè) 置 80?40?20?10?1?0.1 μg/mL 等 6 個(gè)濃度,棉鈴蟲(chóng) (Heliothis armigera)的殺蟲(chóng)活性測(cè)定設(shè)置 200?100? 50?25?5?1 μg/mL等6個(gè)濃度?選取健康的?未經(jīng) 取食的初孵幼蟲(chóng)(孵化后12 h內(nèi), 購(gòu)自河南省濟(jì)源 白云實(shí)業(yè)有限公司)作供試蟲(chóng),用軟毛筆輕移入已 有感染飼料的小孔內(nèi);每孔1頭蟲(chóng),每個(gè)處理重復(fù)3 次?以轉(zhuǎn)化pET28a質(zhì)粒空載體的菌體總蛋白作為 陰性對(duì)照,以未發(fā)生突變的 Vip3Aa11 野生型蛋白 作為陽(yáng)性對(duì)照?在每個(gè)小孔上方鋪上濕潤(rùn)衛(wèi)生紙 后蓋上塑料蓋,以橡皮筋捆緊,豎立放入30 ℃ (棉 鈴蟲(chóng))或25 ℃ (甜菜夜蛾)光照培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司提供）;培養(yǎng)7 d后調(diào) 查 活 蟲(chóng) 數(shù) ,并 觀 察 幼 蟲(chóng) 生 長(zhǎng) 情 況 ,使 用 POLO (1987)軟件計(jì)算致死中濃度(median lethal concentration, LC50)?以野生型Vip3Aa11的LC50與其他殺 蟲(chóng)蛋白LC50的比值作為相對(duì)毒力。

1.7 胰蛋白酶敏感性分析

按照1.4步驟提取Vip3AA11及其突變體蛋白， 以 PBS 溶液(pH 8.0)代替 20 mmol/L Tris-HCl。將 蛋白樣品與1 mg/mL胰蛋白酶按照10∶1的比例混 合均勻，于37 ℃水浴中分別放置2和32 min，加入 5×蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)，然后進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

以pET-vip3Aa11質(zhì)粒為模板,利用含突變位點(diǎn) 的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增?PCR 產(chǎn)物經(jīng) DMT 酶消化 后,取5 μL轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,獲得的單 克隆菌落用vip3AF/R引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定?結(jié)果 顯 示 ,Vip3Aa11 及 其 3 個(gè) 突 變 體 G200S?F442S? S726T均能擴(kuò)增出預(yù)期的2 370 bp目的條帶(圖1), 說(shuō)明陽(yáng)性單克隆菌落中含有vip3Aa11 基因或突變 基因?對(duì)于每個(gè)定點(diǎn)突變樣品，選取2個(gè)經(jīng)PCR鑒定 正確的單克隆進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分 析，均實(shí)現(xiàn)預(yù)期的點(diǎn)突變。

蘇云金芽胞桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白Vip3Aa對(duì)多 種鱗翅目害蟲(chóng)具有較好的殺蟲(chóng)活性,并且被證實(shí)與 目前應(yīng)用較多的殺蟲(chóng)晶體蛋白無(wú)交互抗性,具有廣 闊的應(yīng)用前景?Vip3Aa 類(lèi)蛋白是被發(fā)現(xiàn)?研究報(bào) 道 最 多 的 一 類(lèi) Vip 蛋 白 ,并 且 Vip3Aa19 與 Vip3Aa20 已經(jīng)成功的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物中(Yu et al., 1997; Yu et al., 2001)。